تشخیص PCR ویروس ها تا زمانی که صحت آن قابل درک باشد، مفید است: ظرفیت تشخیص RNA را به مقدار چند دقیقه فراهم می کند، اما اینکه RNA ویروس عفونی را نشان می دهد یا نه، روشن نیست.در طی بررسی شواهد باز انتقال Covid-19 از طریق مدفوع دهانی، متوجه شدیم که چگونه تعداد کمی از مطالعات کشت ویروس SARS-CoV-2 زنده از نمونه های انسانی را امتحان کرده یا گزارش داده اند.
این امر ما را شگفت زده کرد؛ زیرا کشت ویروسی به عنوان یک استاندارد طلایی یا آزمایش مرجع در نظر گرفته می شود که برای فهمیدن خصوصیات پیش بینی آن آزمایش، هر آزمایش شاخص تشخیصی برای ویروس ها باید اندازه گیری و کالیبره شود. در کشت ویروسی، ویروس ها در خطوط سلولی آزمایشگاه تزریق می شوند تا ببینند آیا باعث آسیب سلول و مرگ می شوند یا خیر؛ بنابراین مجموعه ای از ویروس های جدید آزاد می شوند که می توانند سلول های دیگر را آلوده کنند.
بنابراین، ما شواهد حاصل از مطالعات گزارش داده ها در مورد کشت ویروسی، یا جداسازی و همچنین واکنش زنجیره ای ترانس کریپتاز-پلیمراز معکوس (RT-PCR) را بررسی کردیم تا متوجه شویم چگونه نتایج PCR عفونت را انعکاس می دهد.
یافته های ما چه بود؟
ما با استفاده از نمونه هایی از بیماران Covid-19 مطالعاتی که کشت یا جداسازی SARS-CoV-2 را گزارش کرده است، جستجو کردیم.
ما چهارده مطالعه را شناسایی کردیم که موفق به کشت یا مشاهده تهاجم بافتی توسط SARS-CoV از نمونه های مختلف بیماران تشخیص داده شده با Covid-19 شده اند. کیفیت این مطالعات با کمبود پروتکل، روش های استاندارد و گزارش متوسط بود.
داده ها در مورد چگونگی ارتباط نتایج PCR با نتایج کشت ویروسی کم است. برخی شواهد از رابطه بین زمان جمع آوری نمونه تا آزمایش، شدت علائم و احتمال عفونی بودن فرد وجود دارد.
یکی از مطالعاتی که ما یافتیم (Bullard و همکاران) کشت ویروسی را در نمونه های گروهی از بیماران بررسی کرده و نتایج را با داده های آزمایش PCR و زمان بروز علائم آنها مقایسه کرده است.
شکل زیر گزارش شده در پژوهش Bullard نشان می دهد که هنگامی که آستانه چرخه (خط آبی) پایین تر است، احتمال ویروس عفونی SARS-CoV- بیشتر بوده (میله های قرمز) و هنگامی که علائم زمان آزمایش کوتاه تر است- بیش از ۸ روز، هیچ ویروس زنده ای تشخیص داده نشد.
Kampen و همکارانش پخش ویروس عفونی را در ۱۲۹ بیمار بستری شده با کووید-۱۹ بررسی کردند. مدت زمان ریزش ویروس عفونی از ۰ تا ۲۰ روز پس از شروع علائم بود و احتمال تشخیص ویروس عفونی پس از ۱۵ روز پس از شروع علائم به زیر ۵٪ کاهش یافت. آنها همچنین گزارش کردند که میزان ویروس با تشخیص SARS-CoV-2 عفونی مرتبط است و پس از شناسایی آنتی بادی های خنثی کننده در سرم، ویروس غیر عفونی می شود.
هنگامی که نمونه ها گرفته شد برای کشت ویروسی مهم به نظر می رسید. در گزارش موردی، SARS-CoV-2 RT-PCR شناسایی ویروس را تا روز ۶۳ بعد از شروع علائم ادامه داد در حالی که ویروس فقط می تواند از نمونه های تنفسی جمع آوری شده در ۱۸ روز اول جدا شود. در گروهی متشکل از ۵۹ بیمار، پس از توقف افت تنفسی، دفع مدفوع طولانی تر شد. Gupta و همکاران مدت گزارش دادند که زمان دفع مدفوع RNA ویروسی پس از پاکسازی نمونه های تنفسی از ۱ تا ۳۳ روز بود و در یک بیمار تا روز ۴۷ از زمان شروع علائم بود.
ارزیابی کمی دقیق از ارتباط بین نتایج RT-PCR و میزان موفقیت کشت ویروسی در این مطالعات امکان پذیر نبود. این مطالعات به اندازه کافی اندازه گیری نشده بود و به روشی کاملاً استاندارد انجام نگرفته و ممکن است منوط به گزارشی سوگیرانه باشد.
علاوه بر این، زمینه مهم است. سطح آستانه چرخه برای تشخیص ویروس زنده با توجه به شرایط مختلف (بیمارستان در مقابل جامعه) متفاوت خواهد بود و به شدت علائم و مدت زمان علائم و همچنین کیفیت آزمایش بستگی دارد. آستانه چرخه زمانهایی است که آزمایش تقویت باید برای گرفتن نتیجه مثبت تکرار شود. هرچه غلظت ویروسی بیشتر باشد، چرخه های تقویت کمتر نیز ضروری هستند.
چرا قطع آستانه چرخه مهم است؟
RT-PCR از آنزیمی به نام ترانسکریپتاز معکوس برای تغییر قطعه خاصی از RNA به قطعه منطبق DNA استفاده می کند. سپس PCR با دو برابر شدن تعداد مولکولها و بارها، DNA را بصورت نمایی تقویت می کند. یک سیگنال فلورسنت می تواند به نسخه های DNA متصل شود. هنگامی که سیگنال فلورسنت به اندازه کافی تقویت شود تا قابل تشخیص باشد، یک آزمایش مثبت تلقی می شود.
آستانه چرخه (که به آن مقدار Ct گفته می شود) تعداد چرخه های تقویت مورد نیاز برای عبور سیگنال فلورسنت از یک آستانه خاص است. این اجازه می دهد تا نمونه های بسیار کوچکی از RNA تکثیر و شناسایی شود.
هرچه سطح آستانه چرخه کمتر باشد، مقدار RNA (ماده ژنتیکی) بیشتری در نمونه وجود دارد. هرچه تعداد چرخه بیشتر باشد، RNA کمتری در نمونه وجود دارد.
این یافته ها به چه معناست؟
مشکل تشخیص برای شناسایی ویروس RNA در همه جا وجود دارد. SARS-CoV ، MERS ، آنفلوانزای ابولا و RNA ویروسی زیکا مدتها پس از ناپدید شدن ویروس عفونی قابل تشخیص هستند.
سیستم ایمنی بدن برای خنثی سازی ویروس و جلوگیری از عفونت بیشتر کار می کند. در حالی که یک مرحله عفونی ممکن است یک هفته یا بیشتر طول بکشد، زیرا RNA غیرفعال با گذشت زمان به آرامی تخریب می شود اما ممکن است هفته ها پس از ازبین رفتن عفونت نیز شناسایی شود.
تشخیص PCR ویروس ها تا زمانی که محدودیت های آن قابل درک باشد، مفید است. گرچه آن می تواند RNA را در چند دقیقه تشخیص دهد، اما می بایست احتیاط لازم را برای نتایج اعمال کرد زیرا اغلب ویروس عفونی را تشخیص نمی دهد.
چه نتیجه ای می گیریم؟
این مطالعات داده های محدودی را با کیفیت متغیر ارائه می دهند که بعید به نظر می رسد نتایج PCR بتواند کشت ویروسی را از نمونه های انسانی پیش بینی کند. در مورد ارتباط نتایج PCR با بیماری ممکن است توجه کافی نشده باشد. ارتباط با عفونت مشخص نیست و اطلاعات بیشتری در این مورد لازم است.
اگر این مسئله درک نشود، نتایج PCR ممکن است منجر به محدودیت در گروه بزرگی از افرادی شود که خطر عفونت ندارند.
نتایج نشان می دهد که برای درک اینکه چه کسی عفونی است، میزان شیوع چه قدر است و نیز برای کنترل انتقال، باید از قطع بار RNA ویروسی استفاده شود.
منبع: سایت cebm.net
